GC-MS: Газово-хроматографска масспектрометрия — принципи и приложения

Първите научни статии за газово-течна хроматография са публикувани през 1950 г. Химиците използват различни детектори, за да видят, че съединенията излизат от края на хроматографа. Повечето от детекторите унищожавали съединенията, защото ги изгаряли или йонизирали. Тези детектори караха химиците да гадаят за точната идентичност на всяко съединение в пробата. През 50-те години на ХХ век Роланд Голке и Фред Маклафърти разработват нова комбинирана машина. Те използвали масспектрометър като детектор в газовата хроматография. Тези ранни устройства са били големи, крехки и първоначално ограничени до лабораторни условия.

Дизайнът беше сложен. Интервалът от време между различните съединения, излизащи от хроматографа, беше труден за контролиране. Така масспектрометърът трябваше да приключи работата си с едно съединение, преди следващото да излезе от хроматографа. В ранните модели измерванията от масспектрометъра се записваха на графична хартия. Висококвалифицирани химици изучаваха моделите на пиковете, за да идентифицират всяко съединение. През 70-те години на ХХ век към масспектрометрите бяха добавени аналогово-цифрови преобразуватели. Това позволи на компютрите да съхраняват и интерпретират резултатите. Тъй като компютрите стават все по-бързи и по-малки, GC-MS става все по-бърза и се разпространява от лабораториите във всекидневието. Днес компютъризираните GC-MS уреди се използват широко при мониторинга на околната среда - вода, въздух и почва. Използват се и в регулирането на селското стопанство, безопасността на храните и при откриването и производството на лекарства.

Разработването на малки компютри спомогна за опростяването на машините за GC-MS. То също така значително намали времето, необходимо за анализиране на една проба. Electronic Associates, Inc. (EAI) беше водещ американски доставчик на аналогови компютри. През 1964 г. EAI започва разработката на компютърно управляван масспектрометър под ръководството на Робърт Е. Финиган. До 1966 г. са продадени над 500 газоанализатора. През 1967 г. е създадена корпорацията Finnigan Instrument Corporation (FIC). В началото на 1968 г. доставя първите прототипни четириполюсни GC-MS инструменти на университетите Станфорд и Пърдю. В крайна сметка FIC е преименувана на Finnigan Corporation и се утвърждава като световен лидер в областта на GC-MS системите.

GC-MS може да открие всички съединения, които са смесени заедно в даден обект на пробата. Операторът разтваря пробата в течност. След това операторът впръсква течността в поток от газ. (Най-често се използват хелий, водород или азотен газ.) Газът преминава през тръба със специално покритие. Тъй като всяко съединение в пробата полепва по покритието по различен начин, всяко съединение излиза от тръбата по различно време. Така че покритието се използва, за да се отдели всяко съединение, което е било смесено в пробата. Когато всяко съединение излиза в края на тръбата, то се йонизира и получава електрически заряд. Повечето съединения се разпадат, когато се йонизират. Различните парчета попадат под магнит, който разделя парчетата въз основа на тяхното тегло и заряд. След това компютърът измерва всички части на всяко съединение. Като сравнява измерванията с компютърна библиотека от известни съединения, компютърът съставя списък с имената на всички съединения в пробата. Компютърът може също така да определи какво количество от всяко съединение е имало в пробата.

GC-MS се състои от два основни елемента: газов хроматограф и масспектрометър. Газовият хроматограф използва капилярна колона, което зависи от размерите на колоната (дължина, диаметър, дебелина на филма), както и от свойствата на фазата (напр. 5% фенил полисилоксан). Разликата в химичните свойства на различните молекули в дадена смес ще раздели молекулите, докато пробата преминава по дължината на колоната. Молекулите се нуждаят от различно време (наречено време на задържане), за да излязат (елуират) от газовия хроматограф. Това позволява на масовия спектрометър надолу по веригата да улавя, йонизира, ускорява, отклонява и открива йонизираните молекули поотделно. Масспектрометърът прави това, като разделя всяка молекула на йонизирани фрагменти и открива тези фрагменти, като използва съотношението им на маса към заряд.

Тези две машини, използвани заедно, позволяват много по-голяма прецизност при идентифицирането на веществата, отколкото всяко от устройствата, използвани поотделно. Не е възможно да се направи точна идентификация на определена молекула само чрез газова хроматография или масспектрометрия. Процесът на масспектрометрия обикновено изисква много чиста проба. В миналото при газовата хроматография се използваха други детектори, като например пламъчно-йонизационен детектор. Тези детектори не могат да разделят различни молекули, които по една и съща случайност преминават през колоната за едно и също време. (Когато две различни молекули имат едно и също време на задържане, се казва, че те се "коелитират"). Съвместното задържане на молекулите ще обърка компютърните програми, които отчитат един масов спектър за двете молекули.

Понякога две различни молекули могат да имат подобен модел на йонизираните фрагменти в масспектрометъра (масспектър). Комбинирането на двата процеса намалява възможността за грешка. Изключително малко вероятно е две различни молекули да се държат по един и същи начин както в газов хроматограф, така и в масспектрометър. Ето защо, ако масовият спектър съвпада с аналита, който представлява интерес, времето на задържане на този спектър може да се сравни с характерното време на задържане на газовия газ, за да се увеличи увереността, че аналитът е в пробата.

Видове детектори за масспектрометър

Най-разпространеният тип MS, свързан с GC, е квадруполният масспектрометър. Hewlett-Packard (сега Agilent) го предлага на пазара под търговското наименование "Mass Selective Detector" (MSD). Друг сравнително често срещан детектор е масспектрометърът с йонен капан. Освен това може да се намери масспектрометър с магнитен сектор. Тези конкретни инструменти обаче са скъпи и обемисти и обикновено не се срещат в лабораториите за високопроизводителни услуги. Използват се и други детектори, като например време на полет (TOF), тандемни квадруполи (MS-MS) (вж. по-долу) или в случая на MS с йонен капан ⁿ. Числото n показва броя на етапите на масспектрометрията.

Масспектрометърът обикновено се използва по един от двата начина: Пълно сканиране или селективно наблюдение на йони (SIM). Типичният GC-MS може да работи само по двата начина или и по двата едновременно.

Пълно сканиране MS

Когато се събират данни в режим на пълно сканиране, се избира целеви диапазон от масови фрагменти, който се въвежда в метода на инструмента. Пример за типичен широк диапазон от масови фрагменти за наблюдение е от m/z 50 до m/z 400. Определянето на диапазона, който да се използва, до голяма степен се определя от това какво се очаква да има в пробата, като се вземат предвид разтворителят и други възможни смущения. Ако РС търси масови фрагменти с много ниско m/z, то може да открие въздух или други възможни смущаващи фактори. Използването на голям диапазон на сканиране намалява чувствителността на инструмента. Апаратът ще извършва по-малко сканирания в секунда, тъй като всяко сканиране ще отнема повече време, за да открие по-широк диапазон от масови фрагменти.

Пълното сканиране е полезно за определяне на неизвестни съединения в пробата. То предоставя повече информация от SIM, когато става въпрос за потвърждаване или разрешаване на съединения в пробата. Повечето инструменти се управляват от компютър, който работи с компютърна програма, наречена "метод на инструмента". Методът на инструмента контролира температурата в ГХ, скоростта на MS сканиране и обхвата на размерите на фрагментите, които се откриват. Когато химикът разработва метод на инструмента, той изпраща тестови разтвори през GS-MS в режим на пълно сканиране. По този начин се проверява времето на задържане на GC и отпечатъкът на масовия фрагмент, преди да се премине към инструментален метод на SIM. Специализираните GC-MS инструменти, като например детекторите за експлозиви, имат фабрично зареден метод на инструмента.

Мониторинг на избрани йони

При селектирания йонен мониторинг (SIM) методът на инструмента се фокусира върху определени йонни фрагменти. Само тези масови фрагменти се откриват от масспектрометъра. Предимствата на SIM се състоят в това, че границата на откриване е по-ниска, тъй като инструментът разглежда само малък брой фрагменти (напр. три фрагмента) по време на всяко сканиране. Всяка секунда могат да се извършват повече сканирания. Тъй като се наблюдават само няколко масови фрагмента, които представляват интерес, матричните смущения обикновено са по-малки. За да се подобрят шансовете за правилно отчитане на положителен резултат, йонните съотношения на различните масови фрагменти са сравними с известен референтен стандарт.

Видове йонизация

След като молекулите изминат дължината на колоната, преминат през трансферната линия и влязат в масспектрометъра, те се йонизират по различни методи. Обикновено в даден момент се използва само един метод на йонизация. След като пробата се фрагментира, тя се открива, обикновено чрез диод с електронен множител. Диодът третира йонизирания масов фрагмент като електрически сигнал, който след това се открива.

Химиците избират техника за йонизация отделно от избора на Full Scan или SIM мониторинг.

Електронна йонизация

Най-разпространеният вид йонизация е електронната йонизация (EI). Молекулите влизат в РС (източникът е квадрупол или самият йонен капан в РС с йонен капан), където се удрят със свободни електрони, излъчвани от нишка. Това е подобно на жичката, която се намира в стандартната крушка с нажежаема жичка. Електроните удрят молекулите, като предизвикват фрагментация на молекулата по характерен начин, който може да се повтори. Тази техника на "твърда йонизация" води до създаването на повече фрагменти с ниско съотношение на масата към заряда (m/z). При EI има малко, ако изобщо има такива, фрагменти с маса, която е близка до масата на оригиналната молекула. Химиците смятат, че твърдата йонизация е изстрелване на електрони в молекулите на пробата. За разлика от тях "меката йонизация" е поставяне на заряд върху молекулата на пробата чрез удряне с въведен газ. Моделът на фрагментация на молекулите зависи от енергията на електроните, приложена към системата, обикновено 70 eV (електронволта). Използването на 70 eV помага да се сравнят спектрите, генерирани от тестовата проба, с известни библиотечни спектри. (Библиотечните спектри могат да се получат от софтуер, предоставен от производителя, или от софтуер, разработен от Националния институт по стандартизация (NIST - САЩ)). Софтуерът търси в спектрите от библиотеката, като използва алгоритъм за съвпадение, като например съвпадение, основано на вероятност, или съвпадение на точков продукт. Много агенции за стандартизация на методи вече контролират тези алгоритми и методи, за да гарантират тяхната обективност.

Химическа йонизация

При химическата йонизация (CI) в масспектрометъра се вкарва газ-реагент, обикновено метан или амоняк. Съществуват два вида КИ: положителна КИ или отрицателна КИ. И в двата случая газът-реагент ще взаимодейства с електроните и аналита и ще предизвика "мека" йонизация на интересуващата ни молекула. По-меката йонизация фрагментира молекулата в по-ниска степен от твърдата йонизация при ЕИ. Химиците предпочитат CI пред EI. Това е така, защото CI произвежда поне един масов фрагмент с тегло, което е почти същото като молекулното тегло на интересуващия ни аналит.

Положителна химическа йонизация

При позитивната химична йонизация (PCI) газовият реагент взаимодейства с целевата молекула, най-често чрез обмен на протони. По този начин се получават йонни видове в относително големи количества.

Отрицателна химическа йонизация

При отрицателната химична йонизация (NCI) газът-реагент намалява въздействието на свободните електрони върху целевия аналит. Тази намалена енергия обикновено оставя фрагмента в голямо количество. (Фрагментите не се разпадат допълнително.)

Тълкуване

Основната цел на инструменталния анализ е да се измери количество вещество. Това става чрез сравняване на относителните концентрации на атомните маси в генерирания масов спектър. Възможни са два вида анализ - сравнителен и оригинален. Сравнителният анализ по същество сравнява дадения спектър с библиотека от спектри, за да се види дали неговите характеристики са налице за някоя известна проба в библиотеката. Най-добре е това да се извърши с помощта на компютър, тъй като има много визуални изкривявания, които могат да възникнат поради вариации в мащаба. Компютрите могат също така да съпоставят повече данни (като например времената на задържане, идентифицирани от ГК), за да свържат по-точно определени данни.

Друг метод на анализ измерва върховете един спрямо друг. При този метод най-високият връх се определя на 100 %. На останалите пикове се дава стойност, равна на отношението на височината на пика към височината на най-високия пик. Всички стойности над 3 % се присвояват. Общата маса на неизвестното съединение обикновено се посочва от родителския пик. Стойността на този родителски пик може да се използва за вписване в химична формула, съдържаща различните елементи, за които се предполага, че се съдържат в съединението. Моделът на изотопите в спектъра е уникален за елементи, които имат много изотопи. Така че той може да се използва и за идентифициране на различните присъстващи елементи. Това показва общата химична формула на неизвестната молекула. Тъй като структурата на молекулата и връзките се разпадат по характерен начин, те могат да бъдат идентифицирани по разликата в пиковите маси. Идентифицираната структура на молекулата трябва да съответства на характеристиките, регистрирани от GC-MS. Обикновено тази идентификация се извършва автоматично от компютърни програми, които се доставят с инструмента. Тези програми сравняват спектрите с библиотека от известни съединения, които имат същия списък от елементи, които биха могли да присъстват в пробата.

При анализа на "пълния спектър" се разглеждат всички "върхове" в рамките на спектъра. Но при селективния йонен мониторинг (SIM) се наблюдават само избрани пикове, свързани с определено вещество. Химиците приемат, че при дадено време на задържане набор от йони е характерен за определено съединение. SIM е бърз и ефективен анализ. SIM работи най-добре, когато анализаторът има предварителна информация за пробата или търси само няколко специфични вещества. Когато количеството на събраната информация за йоните в даден газхроматографски пик намалява, чувствителността на анализа се увеличава. Така SIM анализът позволява да се открие и измери по-малко количество от дадено съединение. Но степента на сигурност относно идентичността на това съединение намалява.

GC-тандемна MS

Когато се добави втора фаза на фрагментиране на масата, например чрез използване на втори квадрупол в квадруполен инструмент, това се нарича тандемна MS (MS/MS). MS/MS са добри за измерване на ниски нива на целевите съединения в проба с матрица от фонови съединения, които не представляват интерес.

Първият квадрупол (Q1) е свързан с клетка за сблъсък (q2) и друг квадрупол (Q3). Двата квадрупола могат да се използват в сканиращ или статичен режим, в зависимост от вида на използвания MS/MS анализ. Видовете анализ включват сканиране на продуктови йони, сканиране на прекурсорни йони, мониторинг на избрани реакции (SRM) и сканиране на неутрални загуби. Например: Когато Q1 е в статичен режим (разглежда се само една маса, както при SIM), а Q3 е в режим на сканиране, се получава така нареченият продуктов йонен спектър (наричан също "дъщерен спектър"). От този спектър може да се избере изявен продуктов йон, който може да бъде продуктов йон за избрания прекурсорен йон. Двойката се нарича "преход" и е в основата на SRM. SRM е високо специфичен и почти напълно елиминира матричния фон.

Мониторинг и почистване на околната среда

Много химици смятат, че GC-MS е най-добрият инструмент за мониторинг на органични замърсители в околната среда. Цената на GC-MS оборудването е намаляла значително. В същото време надеждността на GC-MS се е повишила. И двете подобрения увеличиха използването в изследванията на околната среда. Някои съединения, като например някои пестициди и хербициди, не могат да бъдат идентифицирани чрез GS-MS. Те са твърде сходни с други сродни съединения. Но за повечето органични анализи на проби от околната среда, включително за много основни класове пестициди, GC-MS е много чувствителен и ефективен.

Криминалистика

GC-MS може да анализира частиците от човешкото тяло, за да помогне за свързването на престъпник с престъпление. Законът приема използването на GC-MS за анализ на останки от пожари. Всъщност Американското дружество за изпитване на материали (ASTM) има стандарт за анализ на пожарни останки. GCMS/MS е особено полезен в този случай, тъй като пробите често съдържат много сложни матрици, а резултатите, използвани в съда, трябва да бъдат много точни.

Правоприлагане

GC-MS се използва за откриване на незаконни наркотици и в крайна сметка може да замени кучетата за търсене на наркотици. Тя се използва често и в съдебната токсикология. Тя помага да се открият наркотици и/или отрови в биологични проби, взети от заподозрени, жертви или мъртъвци.

Защита

След терористичните атаки от 11 септември 2001 г. системите за откриване на експлозиви станаха част от всички летища в САЩ. Тези системи работят с множество технологии, много от които се основават на GC-MS. Има само трима производители, сертифицирани от FAA да предоставят тези системи. Първият е Thermo Detection (преди Thermedics), който произвежда EGIS, линия детектори за експлозиви, базирани на GC-MS. Вторият е Barringer Technologies, който понастоящем е собственост на Smith's Detection Systems. Третата е Ion Track Instruments (част от General Electric Infrastructure Security Systems).

Анализ на храни, напитки и парфюми

Храните и напитките съдържат много ароматни съединения, някои от които се съдържат естествено в суровините, а други се образуват по време на обработката. GC-MS се използва широко за анализ на тези съединения, които включват естери, мастни киселини, алкохоли, алдехиди, терпени и др. Той се използва също така за откриване и измерване на замърсители от разваляне или фалшифициране, които могат да бъдат вредни. Замърсителите често се контролират от правителствени агенции, например пестицидите.

Астрохимия

Няколко GC-MS са напуснали Земята. Два от тях отидоха на Марс в рамките на програмата "Викинг". Венера 11 и 12 и Пионер Венера анализираха атмосферата на Венера с GC-MS. Сондата "Хюйгенс" от мисията "Касини-Хюйгенс" приземи един GC-MS на най-голямата луна на Сатурн - Титан. Материалът в кометата 67P/Чурюмов-Герасименко ще бъде анализиран от мисията Розета с хирална GC-MS през 2014 г.

Медицина

GC-MS се използват в скрининговите тестове за новородени. Тези тестове могат да открият десетки вродени метаболитни заболявания (известни също като вродени грешки в обмяната на веществата). GC-MS може да определя съединения в урината дори в много малки количества. Тези съединения обикновено не присъстват, но се появяват при лица, страдащи от метаболитни нарушения. Това се превръща в обичаен начин за диагностициране на ИЕМ за по-ранно поставяне на диагноза и започване на лечение. Това в крайна сметка води до по-добър изход. Вече е възможно новороденото да бъде изследвано за над 100 генетични метаболитни нарушения чрез тест на урината при раждането, базиран на GC-MS.

В комбинация с изотопно маркиране на метаболитни съединения, GC-MS се използва за определяне на метаболитната активност. Повечето приложения се основават на използването на ¹³С като маркировка и измерването на съотношенията ¹³С-С¹² с масспектрометър за изотопни съотношения (IRMS). IRMS е масспектрометър с детектор, предназначен за измерване на няколко избрани йона и връщане на стойности като съотношения.