Селективен маркер: определение, приложение и видове в генетиката
Селективният маркер е репортерски ген, въведен в клетката заедно с желания вмъкнат ген. Това позволява на експериментатора да установи дали клетките наистина са получили и експресират въведения ген — маркерът дава лесно откриваем признак (напр. преживяване при наличието на антибиотик или видим фенотип).
Най-често селективните маркери се използват при бактерии или за клетки в култура. Те показват успеха на трансфекция или друга процедура, предназначена за въвеждане на чужда ДНК в клетката. Това е стандартна техника в областта на генното таргетиране и генния нокаут.
Най-разпространените селективни маркери са гени за антибиотична резистентност. След трансформация бактериалните клетки се отглеждат върху среда, съдържаща съответния антибиотик; този антибиотик унищожава клетките, които не носят резистентния маркер. Колониите от бактерии, които могат да растат, са приели и изразили въведения генетичен материал.
Алтернатива на селективния маркер е избираемият (скринингов) маркер, който не убива „нежеланите“ клетки, а позволява да се разграничат желаните от нежеланите по видим признак — например флуоресценция или промяна на цвета при оцветяване. Избираемите маркери са полезни, когато селекция чрез оцеляване е нежелателна или невъзможна.
Често срещани примери за маркери
- Антибиотични резистентни гени (бактерии): nptII (канамицин/неомицин), bla/amp (ампицилин), cat (хлорамфеникол), tet (тетрациклин).
- Дроги-резистентни маркери (еукариотни клетки): NeoR (G418/неомицин), Puromycin‑R (пуромицин), HygR (хигромицин), BlastR (бластицидин).
- Ауксотрофни маркери (дрожди): HIS3, LEU2, URA3 — позволяват растеж само при липса на определени хранителни вещества.
- Маркер за растения: bar (резистентност към хербицид фосфинометил/«BASTA»), nptII за селекция при трансгенни растения.
- Избираеми/скринингови репортери: GFP, RFP, luciferase, β‑galactosidase (lacZ) — дават лесно наблюдаеми сигнали без смърт на клетките.
- Отрицателни/контра-селекционни маркери: HSV‑TK (чувствителност към ганцикловир), sacB (чувствителност към сахароза при бактерии) — позволяват отсяване на клетки, носещи маркера, чрез добавяне на специфично свързващо вещество.
Приложения и методи
Селективните и избираемите маркери се използват при клониране на плазмиди, създаване на трансгенни организми, селекция на успешни редактирования при CRISPR/Cas, генен нокаут и други генетични манипулации. Маркерът може да е в същия вектор като гена на интерес или да се въвежда като част от ко‑трансформация.
Практически съображения
- Промотор и експресия: избора на промотор влияе на нивото на експресия на маркера и следователно на ефективността на селекцията.
- Сигурност и регулации: използването на гени за антибиотична резистентност повдига въпроси за биосигурност и трансфер на резистентност; в някои приложения (напр. растения за консумация) се предпочитат алтернативи или системи за премахване на маркера.
- Премахване на маркера: за да се избегнат нежелани ефекти, често се използват системи за ексцизия (Cre‑lox, Flp‑FRT, transposase), които позволяват отстраняване на селективния маркер след успешна селекция.
- Асенсорни техники: при еукариотни клетки често се комбинират селекция и сортиране (FACS) по флуоресценция за по‑бързо изолиране на желаните клонове.
Често срещани проблеми и решения
Някои клетки развиват спонтанна резистентност или получават маркера, но не експресират правилно гена на интерес. За преодоляване се прилагат допълнителни проверки — PCR, секвениране, Western blot или функционални тестове на експресирания продукт. Използването на двустепенна селекция (напр. първо антибиотик, после скрининг по репортер) увеличава вероятността за изолиране на правилните клонове.
В заключение, селективните и избирателните маркери са ключов инструмент в молекулярната биология и генетиката. Правилният избор на тип маркер и внимателното планиране на експеримента намаляват рисковете и ускоряват идентифицирането на успешно трансформирани клетки.
Въпроси и отговори
Въпрос: Какво е избираем маркер?
О: Селектируемият маркер е ген-репортер, въведен в клетка заедно с генна вставка, който позволява на експериментатора да разбере дали правилният ген е в клетката, защото маркерът може да бъде видян или открит.
В: За кои видове клетки най-често се използва селективен маркер?
О: Селективният маркер най-често се използва за бактерии или за клетки в култура.
В: Каква е целта на селективните маркери?
О: Целта на селективните маркери е да покажат успеха на трансфекция или друга процедура, предназначена за въвеждане на чужда ДНК в клетката.
В: При каква техника се използват селективните маркери?
О: Селектируемите маркери се използват при насочване на гени и изключване на гени.
В: Какви са примерите за селективни маркери?
О: Примери за селективни маркери са гените за антибиотична резистентност.
В: Как генът за антибиотична резистентност работи като селективен маркер?
О: Бактериите, които са били подложени на процедура за въвеждане на чужда ДНК, се отглеждат върху среда, съдържаща антибиотик. Антибиотикът унищожава клетките, които нямат резистентен маркер. Колониите от бактерии, които могат да растат, успешно са приели и изразили въведения генетичен материал.
Въпрос: Каква е алтернативата на селективния маркер?
О: Алтернатива на селективния маркер е селективният маркер, който позволява на изследователя да разграничи желаните от нежеланите клетки.
