Нокаут на гени (генен нокаут) — какво е, методи и приложения
Нокаут на гени (генен нокаут) — ясна статия за методи, техники (KO), модели и приложения в изследванията на функцията на гените.
Нокаут на гени е генетична техника, при която един от гените на организма се изключва или заменя с друг, който не работи. Това може да стане чрез премахване, мутиране или вмъкване на промяна в ДНК, която пречи на синтеза на функционален белтък или на експресията на гена.
Организмите, като например нокаутираните мишки, се използват за изучаване на ген, който е секвениран, но чиято функция е неизвестна или непълно известна. Изследователите правят изводи от разликата между нокаутирания организъм и нормалните индивиди. Нокаут често се съкращава като KO.
Генен нокаут (knock-out) често се противопоставя на т.нар. генен нок-ин (knock-in) — при knock-in целен ген или вариант се вмъква в генома, докато при knock-out генът се обезврежда или премахва. За яснота: в текста по-нататък под „нокаут“ разбираме изключване/дезактивация на ген и като отделна стратегия описваме и „knock-in“ за вкарване на нови варианти.
Често използвани методи
- CRISPR–Cas9: най-широко използваният съвременен метод. Гидиращия РНК (gRNA) насочва Cas9 ендонуклеазата до целева последователност, където се прави разрез в ДНК. Неразрезаните ремонти често въвеждат малки индели, които предизвикват раменно изместване и загуба на функция на белтъка (нокаут). За knock-in се използва донорен шаблон за хомоложна рекомбинация.
- Хомоложна рекомбинация в ембрионални стволови (ES) клетки: класически подход за създаване на нокаутирани мишки. Би трябвало да се отбележи, че е по-бавен от CRISPR и изисква селекция на клетъчни клони.
- ZFNs и TALENs: по-ранни инструменти за целенсно разкъсване на ДНК. Все още се ползват в някои приложения, но в много случаи са заменени от CRISPR поради по-лесната проектираемост на gRNA.
- Cre–LoxP и Flp–FRT системи: използват се за условни (conditional) или тъканно-специфични нокаути. Генът е „флокиран“ (floxed) с LoxP сайтове и се изключва само при наличие на Cre рекомбиназа в определени клетки или при зададено време/стимулация.
- RNAi и антисенсни подходи: не са истински нокаути — те предизвикват „нокаутиране на нивото на РНК“ (knockdown) чрез намаляване на експресията, което е частично и често временено.
Видове нокаут и стратегии
- Герминативни (постоянни) нокаути: модификацията се въвежда в зародишните клетки и се предава на следващите поколения.
- Соматични нокаути: гена се изключва само в соматични клетки на индивида (например при терапевтични интервенции в клетки на пациент).
- Условни/тъканно-специфични нокаути: незаменими гени могат да бъдат нокаутирани само в даден тип тъкани или след приложение на индуциращ агент, което позволява изучаване на функцията им без да се нарушава развитието на организма.
Приложения
- Функционална геномика: определяне ролята на невроизразявани или непознати гени чрез наблюдение на фенотипни промени.
- Модели на човешки болести: създаване на животински модели (например нокаутирани мишки) за изследване на патогенезата и тестване на лекарства.
- Разработване на лекарства и таргетирана терапия: валидиране на лекарствени цели чрез генетично премахване на мишена.
- Селско стопанство и биотехнологии: създаване на култури и животни с полезни характеристики чрез премахване на нежелани функции (устойчивост на болести, подобрено качество и т.н.).
- Изследвания в развитието и физиологията: разкриване на ролята на гени в развитието на органи, поведение, метаболизъм и имунен отговор.
- Възможни терапевтични приложения: somatic gene editing за лечение на генетични заболявания чрез нокаутиране на вредни варианти или на мозък/чернодробни мишени.
Ограничения и етични въпроси
- Оф-таргет ефекти: неспецифични промени в други части на генома могат да доведат до неочаквани фенотипи. Те се проверяват чрез секвениране и контроли.
- Мозаицизъм: при ранни ембрионални редакции някои индивиди могат да съдържат смесица от редактирани и неедитирани клетки.
- Компенсация от паралози: губенето на функция на един ген понякога се маскира от активността на други гени с подобна функция.
- Етични и регулаторни аспекти: редакцията на човешки зародишни клетки и геномна промяна, която се предава към следващите поколения, повдига сериозни етични въпроси и в много страни е ограничена или забранена. Соматичните интервенции имат по-широка клинична перспектива, но също изискват внимателна оценка на безопасността и ефикасността.
В обобщение, нокаутът на гени е мощен инструмент за разбиране на биологията и разработване на нови терапии и приложения, но изисква внимателен експериментален дизайн, контрол за оф-таргет ефекти и етичен обзор преди прилагане в клинични или генетично значими контексти.
Метод
Нокаут се постига чрез комбинация от техники. Започва се от епруветката с плазмид или друг ДНК конструкт и се преминава към клетъчна култура.
Отделните клетки се трансформират генетично с ДНК конструкцията. Често целта е да се създаде животно, което да притежава променения ген.
Ако това е така, ембрионалните стволови клетки се трансформират генетично и се поставят в ранни ембриони. Получените животни с генетична промяна в зародишните си клетки често могат да предадат нокаута на гена на следващите поколения.
Въпроси и отговори
Въпрос: Какво е нокаут на гени?
О: Нокаут на гени е генетична техника, при която един от гените на организма се изключва или заменя с друг, който не работи.
В: Защо се използват нокаутиращи мишки?
О.: Нокаутиращите мишки се използват за изучаване на ген, който е секвениран, но чиято функция е неизвестна или непълно известна.
В: Какво могат да направят изследователите от разликата между нокаутираните организми и нормалните индивиди?
О: Изследователите могат да направят изводи от разликата между нокаутирания организъм и нормалните индивиди.
В: Какво е съкращението на "нокаут"?
О: Съкращението за нокаут е KO.
В: Какво представлява генното нокаутиране?
О.: Генен нокаут е обратното на генния нокаут, при който се включва ген или се вмъква работещ ген.
В: По какво се различава генното нокаутиране от генното изключване?
О: Генното нокаутиране е противоположно на генното нокаутиране; докато при генното нокаутиране се изключва или заменя ген, който не работи, при генното нокаутиране се вмъква работещ ген.
В: Каква е целта на използването на техниките нокаут или нокаут-ин?
О: Целта на използването на техники за нокаут или нок-ин е да се научи повече за функцията на гени, които са секвенирани, но не са напълно разбрани.
обискирам