Трансформация в молекулярната биология – приемане и експресия на ДНК

Трансформация в молекулярната биология: как бактерии приемат и експресират чужда ДНК, механизми, компетентност и приложения за генетични изследвания и трансфекция.

В молекулярната биология трансформацията е генетична промяна на клетката чрез директно приемане и експресия на ДНК от заобикалящата я среда. Приета и експресирана чужда ДНК може да съществува като автономен генетичен елемент (напр. плазмид) или да се интегрира чрез рекомбинация в хромозомата на приемната клетка.

Трансформацията се случва естествено при някои видове бактерии, а може да се извърши и по изкуствен път. Бактериите, които са способни да се трансформират, независимо дали по естествен или изкуствен начин, се наричат компетентни. Естествената компетентност е регулируем процес, контролиращ се от набор от гени и външни сигнали (напр. плътност на популацията — quorum sensing), и е характерна за видове като Streptococcus, Neisseria и Bacillus. Изкуствено клетките се правят компетентни чрез физични или химични методи.

Механизъм на придобиване и експресия

За да доведе до фенотипна промяна, приетата ДНК трябва не само да навлезе в клетката, но и да бъде стабилна и да се експресира. Това включва:

• внедряване на ДНК през клетъчната стена и мембрани;
• защитата на ДНК от нуклеази в средата и в клетката;
• наличието на подходящи регулаторни елементи (промотори, терминатори) и съвместимост на генетичните елементи (напр. origin of replication при плазмиди);
• възможност за транслация и правилно сгъване/модификация на белтъците в зависимост от типа клетка (прокариотна vs еукариотна) и кодонната употреба.

Естествена и изкуствена компетентност

Естествената компетентност се активира чрез специфични сигнали и води до преминаване на единичноверижна или двуверижна ДНК през клетъчната мембрана. При изкуствените методи учените контролират условията, за да повишат приема на ДНК. Важно е разграничението между термините: за бактерии и микроорганизми обичайно се използва думата трансформация, а за въвеждане на чужда ДНК в еукариотни клетки често се използва терминът "трансфекция", макар че терминологията понякога се припокрива.

Практически методи за трансформация

• Химично индуцирана компетентност — широко разпространен метод за Escherichia coli (напр. обработка с калциев хлорид, последвана от шок с повишена температура). При този подход плазмидната ДНК преминава през мембраната в резултат на промяна в пропускливостта.
• Електропорация — кратък високоволтов електрически импулс създава пори в клетъчната мембрана, позволяващи навлизане на ДНК; приложима е както за бактерии, така и за еукариоти и растителни клетки.
• Трансфекция при еукариоти — включва химични методи (липофекция, калциев фосфат), физични (микроинжекция, биолистика/“gene gun”) и вирусни вектори; изборът зависи от типа клетка и целта (временна експресия срещу стабилна интеграция).
• Естествен трансфер — използване на естествени механизми като конюгация и трансдукция (в комбинация с трансформация) за генетични манипулации в специфични системи.

Фактори, влияещи трансформацията

• качество и форма на ДНК (суперспиралирани плазмиди често трансформират по-ефективно от линеарни молекули);
• фаза на растеж на клетките (ми-логаритмична фаза често дава по-висока трансформация);
• физико-химични условия (йонна сила, температура, електропорационни параметри);
• наличие на селективни маркери (напр. антибиотична резистентност) за идентифициране на трансформанти;
• рекомбиназни системи на гостоприемника — за интеграция на линейна ДНК е необходима гомоложна рекомбинация.

Оценка и ефективност

Ефективността на трансформация обикновено се изразява като брой трансформанти на единица маса ДНК (напр. трансформанти/µg). За различни методи и организми тази стойност варира широко. За успешна експериментация се използват контролни трансформации (положителни и отрицателни), за да се провери дали процедурата е протекла правилно.

Приложения и безопасност

Трансформацията е основен инструмент в генетичната инженерия и биотехнологиите. Често приложения:

• клониране на гени и производство на рекомбинантни белтъци (напр. инсулин);
• генетична функционална експертиза чрез екзпресия или заглушаване на гени;
• създаване на трансгенни организми и изследвания в генетиката на развитие;
• биомедицински и клинични приложения, включително вектора за генна терапия (където вместо трансформация често се използват вирусни вектори и други техники).

Работата с трансформирани организми подлежи на строги лабораторни и регулаторни изисквания за биосигурност и етично използване. Използването на генетично модифицирани организми (ГМО) изисква подходящи контейнментни мерки и одобрение от регулаторни органи.

В обобщение, трансформацията — естествена или индуцирана — е мощен и многостранен процес, който позволява въвеждането и експресията на външна ДНК в клетки. Тя стои в основата на съвременните изследвания в молекулярната биология, биотехнологиите и медицината, като продължава да се развива чрез усъвършенстване на методите и повишаване на безопасността и ефективността.

Въпроси и отговори

В: Какво представлява трансформацията в молекулярната биология?

В: При кои видове бактерии трансформацията протича естествено?

В: Какъв е терминът, използван за бактериите, които могат да се трансформират?

В: Кои са другите два процеса, чрез които външен генетичен материал може да бъде внесен в бактериалните клетки, освен трансформацията?

В: Може ли трансформацията да се извърши изкуствено?

В: Какво е определението за трансфекция?

В: По какво трансдукцията се различава от трансформацията?

Търсене по буква