Редактиране на генома: как работят CRISPR, ZFN и други методи

Научете как работят CRISPR, ZFN и други методи за редактиране на генома — принципи, приложения и етични предизвикателства в модерната генетика.

Редактирането на генома е вид генно инженерство.

ДНК се вмъква, заменя или отстранява от генома с помощта на изкуствено създадени нуклеази или "молекулярни ножици". Нуклеазите правят специфични двойно-верижни скъсвания (DSB) на желани места в генома. Собствените механизми на клетката поправят индуцираните прекъсвания чрез естествени процеси.

Понастоящем се използват четири семейства конструирани нуклеази.

За да се разбере функцията на даден ген или белтък, човек се намесва в него по специфичен за последователността начин и наблюдава ефекта върху организма. При някои организми обаче е трудно или невъзможно да се направи мутация, специфична за мястото. Затова трябва да се използват по-непреки методи. Примери за това са:

• Заглушаване на интересуващия ни ген чрез кратка РНК интерференция (siRNA). Въпреки това прекъсването на работата на гените чрез сиРНК може да бъде променливо и непълно.

• Редактиране на генома с нуклеази като ZFN. Това е различно от сиРНК. Конструираната нуклеаза (ензимът, който реже ДНК) е в състояние да модифицира свързването на ДНК. Следователно по принцип може да се реже всяка целева позиция в генома и да се променят последователностите на гени, които не могат да бъдат конкретно насочени чрез конвенционалната РНКи.

Редактирането на генома беше избрано от Nature Methods за метод на годината за 2011 г. Техниката вече се използва, но имплантирането на модифицирани ембриони в жена все още не е разрешено.

Как работят основните методи

Основната стратегия при повечето техники за редактиране на генома е да се създаде специфично разкъсване в ДНК и да се използват клетъчните механизми за поправка за постигане на желаната промяна. Двата основни пътя за поправка са:

• Неспецифично сливане (NHEJ) – бърз и често неточен механизъм, който може да въведе малки индели (вмъквания/изтривания) и да предизвика загуба на функция на гена.
• Хомоложно насочена поправка (HDR) – използва матрица (донорна ДНК) за прецизна замяна или вмъкване, но е по-рядка и по-ефективна при клетки, които са в определени фази на клетъчния цикъл.

Конструкции и характеристики на четирите семейства нуклеази

Meganucleases (хоминг ендонуклеази) – природни ендонуклеази с дълга разпознаваща последователност. Те са високо специфични, но тяхното пренасочване към нови цели е технически трудно.

ZFN (Zinc Finger Nucleases) – съставени от свързващи фрагменти (цинкови пръсти), които разпознават кратки последователности (обикновено ~3 bp на пръст), съединени с катализаторния домейн FokI. FokI трябва да димерира, затова се използват по два ZFN на срещуположни вериги. Предимство: могат да бъдат насочени към много цели; недостатък: трудна и скъпа конструкция и възможни оф-тARGET ефекти.

TALENs – състоят се от повторени мотиви (TALE), всеки разпознава един нуклеотид, свързани с домейна FokI. TALEN предлагат лесно програмиране за специфични целеви места и обикновено имат по-нисък оф-тARGET профил от ZFN, но са по-големи и трудни за доставяне в някои клетки.

CRISPR–Cas системи – най-широко използваната технология днес. Тя използва РНК-насочване: кратка водаческа РНК (gRNA) хибридизира с целевата ДНК и води Cas ензима (напр. Cas9) до мястото на разкъсване. За много Cas протеини е необходима специфична съседна последователност (PAM), напр. "NGG" за SpCas9. Предимства: лесно пренасочване чрез смяна на guide-RNA, висока ефективност; недостатъци: потенциални оф-тARGET ефекти и ограничения от наличието на PAM.

По-нови технологии без двойно-верижни разкъсвания

За да се намалят нежеланите промени, бяха разработени техники, които не изискват класическо DSB:

• Base editors – съчетават деамирази (които променят база C→U или A→I) с ненапълно активен Cas (nCas9 или dCas9), за да извършат прецизни преобразования като C→T (G→A) или A→G (T→C) без DSB.
• Prime editing – използва nCas9, свързан с обратна транскриптаза и специална guide РНК (pegRNA), позволяваща въвеждането на много видове малки промени (вмъквания, изтривания и замени) с по-малко странични ефекти от HDR.

Доставка и приложимост

Ефективността на редактирането зависи силно от начина на доставка на редакторите в клетката:

• Векторни системи (напр. адено-асоциирани вируси, AAV) – често използвани за in vivo терапии, но имат ограничения по капацитет и имуногенност.
• Недиференциални методи – електропорация, липидни наночастици, нуклеофекция – подходящи за ex vivo лечение на клетки, които после се връщат в пациента.

Приложения

Редактирането на генома има широк спектър от приложения:

• Фундаментални изследвания – за разбиране на функцията на гени и генетични пътища.
• Селско стопанство – за създаване на сортове и породи с желани свойства като устойчивост към болести.
• Медицина – терапевтични подходи (напр. ex vivo редактиране на хемопоетични клетки за лечение на наследствени кръвни заболявания, CAR-T терапии), ваксини и диагностични инструменти.

Рискове, контрол и етика

Основните предизвикателства включват оф-тARGET мутации, непълна ефективност, имунни реакции и етични въпроси при редактиране на наследствен материал. Поради това:

• Процедурите за редактиране се валидират чрез дълбоко секвениране, анализ на оф-тARGET сайта и функционални тестове.
• Гермлайн (наследствено) редактиране на човешки ембриони е предмет на строг регулаторен и етичен контрол и в повечето страни е забранено или сериозно ограничено. В много страни обаче протичат клинични изпитвания с соматично (несистемно за поколения) редактиране на клетки за лечение на заболявания.

Какво да очакваме в бъдеще

Понастоящем научната общност продължава да усъвършенства точността и безопасността на техниките (високо-фиделити Cas варианти, оптимизация на guide-RNA, по-добри доставни системи). Същевременно се развиват и алтернативни подходи като base и prime редактирането, които обещават по-прецизни корекции с по-малко рискове. Важно е медицинските и етичните рамки да се развиват паралелно с технологичния прогрес, за да се гарантира безопасно и отговорно приложение.

Ключови термини: двойно-верижно скъсване (DSB), NHEJ, HDR, оф-тARGET ефект, PAM, base editing, prime editing.

Въпроси и отговори

В: Какво представлява редактирането на генома?

В: Как се използват изкуствените нуклеази при редактирането на генома?

В: Кои са някои примери за непреки методи, използвани за разбиране на функцията на гените?

Въпрос: Защо редактирането на генома беше избрано за метод на 2011 г. на Nature Methods?

В: Има ли различни видове модифицирани нуклеази, които могат да се използват за редактиране на генома?

В: По какво сиРНК се различава от другите методи за разбиране на функцията на гените?

В: Разрешено ли е понастоящем имплантирането на модифицирани ембриони в жена?

Търсене по буква