Заглушаване на гени — епигенетични механизми, метилиране и RNAi

Заглушаването на гените е общ термин, който описва епигенетичните процеси на регулиране на гените. Използва се за описание на "изключването" на даден ген чрез механизъм, различен от генното инженерство. Това означава, че ген, който би бил експресиран ("включен") при нормални обстоятелства, се изключва от механизъм в клетката. Когато даден ген е заглушен, това означава, че неговата РНК не е в състояние да произвежда протеин. За разлика от промени в самата ДНК (мутации), повечето епигенетични промени са обратими и могат да се предават на дъщерни клетки при делене; те включват химически модификации на ДНК и на белтъци около нея, както и действието на различни некодиращи РНК.

Гените се регулират или на транскрипционния етап, или по-късно, преди транслацията. Разликата е важна: при транскрипционното заглушаване генът не се транскрибира в мРНК, а при посттранскрипционното мРНК е налична, но не достига до образование на функционален протеин.

Транскрипционно заглушаване — хроматин и ДНК метилиране

Транскрипционното заглушаване на гените се извършва чрез модификации на хистоните, които поставят хетерохроматин около гена. Това означава, че транскрипционният механизъм (РНК полимераза, транскрипционни фактори и др.) не може да достигне до гена. Гените могат да бъдат заглушени чрез метилиране на ДНК. Това се случва редовно по време на развитието, когато гените се включват и изключват на различни етапи.

Някои ключови детайли и компоненти:

• Метилиране на ДНК: метиловите групи обикновено се поставят върху цитозините в CpG-динуклеотиди, образувайки 5-метилцитозин. Фамилиите DNA метилтрансферази (например DNMT1 за поддържане, DNMT3A/3B за de novo метилиране) налагат и поддържат тези маркировки. Този механизъм често потиска транскрипция при промоционни региони.
• Хистонови модификации: различни модификации (метилиране, ацетилиране, фосфорилиране и др.) влияят на плътността на хроматина. Например, H3K9me3 и H3K27me3 са свързани със заглушаване, а ацетилирането на хистоните (напр. H3K9ac) е свързано с активна транскрипция. Ензими като хистон-деацетилази (HDAC) и хистон метилтрансферази регулират тези процеси.
• Структурни комплекси: комплекси като Polycomb и NuRD допринасят за оформянето на устойчиво репресивен хроматин и могат да "спрейдват" заглушаващата промяна върху съседни региони (position-effect variegation е класически пример в модели като дрозофила).
• Деметилиране: ензими от семейството TET могат да участват в активното деметилиране и съответно да възстановят възможността за транскрипция.

Посттранскрипционно заглушаване — некодиращи РНК и RNAi

Посттранскрипционното заглушаване на гени се извършва чрез блокиране или унищожаване на мРНК на определен ген. Унищожаването на мРНК предотвратява транслацията, за да се образува активен генен продукт (в повечето случаи протеин). Често срещан начин за заглушаване на мРНК е РНКи.

По-подробно за RNAi и свързаните механизми:

• siRNA и miRNA: Дълги двуверижни РНК се разрязват от ензима Dicer до 21–22 нуклеотида дълги малки РНК (siRNA). Те се зареждат в RISC-комплекса, където Argonaute медиаторите водят до смърт или блок на мРНК. miRNA, които са ендогенни, обикновено имат непълно съвпадение с целевите мРНК и потискат транслацията и/или насърчават деградацията на мРНК.
• piRNA: в зародишните клетки piRNA взаимодействат с Piwi протеини и играят ключова роля в заглушаването на транспозони и поддържането на геномната цялост.
• Дълги некодиращи РНК (lncRNA): някои от тях (напр. XIST при инактивиране на X-хромозомата) покриват големи хромозомни региони и привличат репресивни комплекси за оформяне на хетерохроматин.

Функции и биологично значение

Заглушаването на гените служи за няколко важни биологични цели:

• Контрол на развитието и клетъчната диференциация — определя кои гени се изразяват в определени тъкани и етапи.
• Имунна защита на генома — методите за заглушаване предпазват генома от активност на транспозони и вируси. По този начин заглушаването на гените може да е част от древна имунна система, която защитава клетките от такива инфекциозни ДНК и РНК.
• Геномна импринтинг и X-инaктивиране — някои гени се експресират само от един родителски алел в резултат на импринтинг, а XIST медиира инaктивирането на една от X-хромозомите при женските бозайници.

Клинично значение и приложения

Аномалии в механизмите на заглушаване водят до заболявания:

• Рак — хиперметилиране на промотори и заглушаване на онкопротектори (tumor suppressor genes) е често срещан механизъм в туморите.
• Развитийни нарушения — нарушения в импринтинга причиняват състояния като Prader–Willi и Angelman. Фрагил X синдром е свързан с разширяване на CGG повтарящи се последователности и последващо метилиране на промотора.
• Терапевтични подходи — съществуват лекарства, които възстановяват експресията на заглушени гени (напр. инхибитори на DNMT като 5-азацитидин, инхибитори на HDAC). RNAi се използва като експериментален и клиничен инструмент (siRNA терапии, анттисенс олигонуклеотиди), а dCas9-инструменти (CRISPRi) позволяват насочено епигенетично репресиране.

Методи за изследване

За да се изследва заглушаването и епигенетичните маркировки, използват се различни техники:

• Бисулфитово секвениране и метилационни масиви за картографиране на метилиране на ДНК.
• ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing) за откриване на хистонови модификации и свързани белтъци.
• RNA-seq за анализ на експресията на гени и некодиращи РНК.
• ATAC-seq и други методи за оценка на отворения хроматин и достъпността на геномните региони.

В обобщение, заглушаването на гените представлява комплексна мрежа от механизми — от химически промени върху ДНК и хистони до дейността на малки и дълги некодиращи РНК — които заедно контролират кога и къде даден ген ще бъде активен. Разбирането на тези процеси е ключово за биологията на развитието, за разбирането на болести и за разработването на нови терапии.

Въпроси и отговори

В: Какво представлява заглушаването на гените?

Въпрос: Как работи транскрипционното заглушаване на гени?

В: Как действа посттранскрипционното заглушаване на гените?

Въпрос: Кои са някои методи, използвани за регулиране на гените?

В: За каква цел служи заглушаването на гените?

В: Участва ли метилирането на ДНК в заглушаването на гените?

Търсене по буква