Насочена еволюция: метод за протеиново инженерство и създаване на ензими

Насочената еволюция (DE) е метод, използван за производство на ензими за промишлени или медицински цели.

Методът е протеиново инженерство, което имитира естествения подбор.

Основната идея е даден ген да бъде подложен на многократни мутации, за да се създаде библиотека от варианти. Селекцията изолира гени с желаната функция. Те са шаблон за следващия кръг.

Това може да се направи in vivo (в живи клетки на бактерии или дрожди) или in vitro (свободно в разтвор или микрокапки).

Тестването на повече мутанти увеличава шансовете за намиране на мутант с желаните свойства.

По време на еволюцията in vivo всяка клетка (обикновено бактерии или дрожди) се трансформира с плазмид, съдържащ различен член от библиотеката с варианти. Само интересуващият ни ген се различава между клетките, като всички останали гени остават същите.

Клетките експресират протеина в цитоплазмата или на повърхността си, където може да се провери неговата функция. Предимството на този формат е, че се подбират свойства в клетъчна среда, което е полезно, когато еволюиралият протеин или РНК трябва да се използва в живи организми.

Когато се извършва без клетки, DE използва транскрипция in vitro за производство на протеини или РНК свободно в разтвор или в изкуствени микрокапчици. Предимството на това е, че се допускат повече условия (напр. температура, разтворители). При него могат да се експресират протеини, които биха били токсични за клетките. Освен това при експериментите за ин витро еволюция могат да се генерират много по-големи библиотеки (до ^1015), тъй като не е необходимо библиотечната ДНК да се вкарва в клетките. Това често ограничава възможностите за работа.

Как работи насочената еволюция — цикъл и стратегии

Насочената еволюция включва няколко повторяеми стъпки, които формират един цикъл:

Генериране на разнообразие: чрез мутагенеза или рекомбинация се създава библиотека от генетични варианти.
Експресия: вариантите се експресират като протеини или РНК in vivo или in vitro.
Селекция или скрининг: идентифицират се варианти с подобрени или желани свойства.
Репликиране на победителите: избраните гени служат като шаблон за следващия кръг (итерация), което позволява натрупване на подобрения.

Повтарянето на тези цикли води до натрупване на полезни промени и често до непредвидими взаимодействия между мутации (епистазис), които не могат да се предвидят лесно с рационален дизайн.

Методи за създаване на вариации

Еrror-prone PCR — използва се при усилване на гена при условия, които повишават честотата на грешки на ДНК полимеразата.
DNA shuffling (рекомбинация) — фрагментиране и повторно сглобяване на родствени гени, което комбинира полезни участъци от различни родители.
Site-saturation и site-directed mutagenesis — насочени промени на конкретни позиции за изследване на роля на аминокиселини.
Рандомни библиотеки на пептиди и гени — заделяне на области с висока разнообразност.

Селекция и скрининг

Изборът на подход зависи от свойството, което търсим. Основни подходи:

Селекция — условия, при които само желаните варианти оцеляват или дават предимство (напр. растеж върху специфичен източник на енергия).
Скрининг — високопропусквателни тестове, при които индивидуални варианти се измерват за активност, стабилност или други показатели (напр. цветова промяна, флуоресценция).
Флоу-цитометрия (FACS) и микрофлуидика — позволяват бързо сортиране на милиони клетки или капки въз основа на сигнал, свързан с активността на протеина.
Фаген, дрожди и рибозомни дисплеи — техники за свързване на генотип и фенотип, улесняващи селекция без нужда от индивидуално подреждане.

Приложения

Насочената еволюция има широки приложения:

Създаване на по-ефективни и устойчиви промишлени ензими (напр. за производство на биогорива, храни, текстил и химикали).
Подобряване на лекарства — развитие на ензими за синтез на фармацевтични междинни продукти и подобряване на антитела.
Диагностични инструменти и биосензори с повишена чувствителност.
Научни изследвания — проучване на белтъчни функции и еволюционни пътища.

За работата в полето на насочената еволюция Frances H. Arnold получи Нобелова награда за химия (2018) за развитието на метода.

Предимства и ограничения

Предимства: не се нуждае от пълно разбиране на структурата; може да открие неочаквани решения и комбинации от мутации; приложима към широк спектър от белтъци.
Ограничения: изисква добри селекционни системи; някои цели са трудни за измерване бързо; експерименти in vivo могат да бъдат ограничени от трансформация и токсичност; in vitro подходите могат да изискват скъпо оборудване (микрофлуидика).

Комбинация с други подходи и бъдеще

Насочената еволюция често се комбинира с рационален дизайн, структурна биология и изчислителни методи (вкл. машинно обучение). Така може да се намали необходимия брой експериментални варианти и да се ускори оптимизацията. Технологичният напредък в секвенирането, автоматизацията и микрофлуидиката продължава да увеличава обхвата и скоростта на тези експерименти.

Сигурност и етика

Работата с модифицирани организми или гени трябва да се провежда при подходящи биобезопасни условия и регулаторен контрол. Важно е да се оценят рисковете от разпространение и нежелани екологични ефекти и да се следват добри лабораторни практики и етични принципи.

Насочената еволюция е мощна и гъвкава техника за проектиране на биологични молекули — от подобряване на промишлени ензими до създаване на нови терапевтични средства. Успехът ѝ зависи както от креативността в създаването на библиотеки, така и от чувствителността и пропускателната способност на използваните селекционни и скринингови методи.

Пример за насочена еволюция в сравнение с естествената еволюция. Вътрешният цикъл показва трите етапа на цикъла на насочената еволюция с имитирания естествен процес в скоби. Външният кръг показва етапите в типичен експеримент. Червените символи показват функционални варианти, а бледите - варианти с намалена функция

Осигуряване на наследственост

Когато са изолирани функционални белтъци, е необходимо да бъдат изолирани и техните гени, следователно е необходима връзка генотип-фенотип.

Това може да бъде ковалентно, когато генът на мРНК се свързва с протеина в края на транслацията чрез пуромицин.

Алтернативно протеинът и неговият ген могат да се съхраняват заедно или в капчици емулсия. Изолираните генни последователности след това се размножават чрез PCR или чрез трансформирани бактерии-гостоприемници. Като шаблон за следващия кръг мутагенеза може да се използва или най-добрата последователност, или група от последователности. Повтарящите се цикли на диверсификация-отбор-размножаване създават ензимни вариации, адаптирани към процеса на подбор.

Експресираният белтък може да бъде ковалентно свързан с гена си (както при мРНК), вляво, или да бъде поставен в същото отделение с него, вдясно. И в двата случая генът, който кодира протеина, е изолиран.

Присъдена награда

Американският инженер Франсис Арнолд получи наградата на хилядолетието за технологии за пионерство в областта на насочената еволюция.

Въпроси и отговори

В: Какво представлява насочената еволюция?

О: Насочената еволюция (DE) е метод, използван за производство на ензими за промишлени или медицински цели. Това е форма на протеиново инженерство, която имитира естествения подбор.

В: Как работи насочената еволюция?

О.: Насочената еволюция работи, като подлага даден ген на многократни кръгове на мутация, създавайки библиотека от варианти. След това селекцията изолира гени с желаната функция, които се използват като шаблони за следващия кръг.

В: Къде може да се извърши насочената еволюция?

О: Насочената еволюция може да се извърши in vivo (в живи клетки на бактерии или дрожди) или in vitro (свободно в разтвор или микрокапки).

В: Какви са предимствата на насочената еволюция in vivo?

О: Предимството на насочената еволюция in vivo е, че се подбират свойства в клетъчна среда, което е полезно, когато еволюиралият протеин или РНК трябва да се използва в живи организми.

В: Какви са предимствата на насочената еволюция in vitro?

О: Предимството на насочената еволюция in vitro е, че позволява повече условия (напр. температура, разтворители) и може да експресира протеини, които биха били токсични за клетките. Освен това може да се генерират много по-големи библиотеки, тъй като не е необходимо ДНК да се вкарва в клетките.

Въпрос: Какво ограничава това, което може да се направи по време на ин витро експеримент?

О: Ограничението на размера на това, което може да се направи по време на ин витро експеримент, често се определя от това колко ДНК трябва да се вкара в клетките.