ELISA (ензимен имуносорбентен анализ) — определение, принцип и приложение

ELISA (ензимен имуносорбентен анализ) — ясно определение, принцип, методика и приложения в диагностика и научни изследвания. Как работи, чувствителност и практическо използване.

Методът ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) е техника, използвана в биохимията, за да се определи дали определено вещество - като например специфичен цитокин или антиген - присъства в пробата. Понякога се използва съкращението "EIA".

Принцип на метода

ELISA се основава на специфичната връзка антитяло–антиген. Антителата или антигените се свързват към повърхността на твърда фаза (обикновено микроплака с 96 кладенци). След серия от инкубации и промивки, свързаните молекули се откриват чрез конюгат на антитялото с ензим (най-често HRP - хемопероксидаза или AP - алкална фосфатаза). При добавяне на подходящ субстрат ензимът катализира реакция, която води до промяна на цвета (или луминесценция/флуоресценция), а интензитетът на сигнала е пропорционален на количеството целево вещество.

Основни разновидности на ELISA

• Директен ELISA — детекция със свързано директно към антигена ензим-конюгирано антитяло. Прост и бърз, но с по-ниска чувствителност.
• Индиректен ELISA — използва неръжимо (несвързано) първично антитяло и ензим-конюгирано вторично антитяло за засилване на сигнала.
• Сандвич ELISA — първично „улавящо“ антитяло е покрито върху плочата, след което се добавя пробата и след това детекционно антитяло. Подходящ за сложни образци и често използван за количествено определяне на протеини и цитокини.
• Конкурентен ELISA — използва се за малки молекули (хаптени) или когато има само едно налично антитяло; сигналът е обратно пропорционален на количеството целева молекула в пробата.

Стандартна процедура (основни стъпки)

• Покриване (coating) на плочата с улавящо антитяло или антиген и инкубация.
• Блокиране на свободните места с белтъчен блокер (напр. BSA, сухо мляко), за да се намали неспецифичното свързване.
• Добавяне на пробата (серум, плазма, клетъчен културен супернатант и др.) и инкубация за свързване.
• Промивки за отстраняване на несвързан материал.
• Добавяне на детекционно антитяло (или ензим-конюгирано антитяло) и инкубация.
• Промивки и добавяне на подходящ субстрат (напр. TMB за HRP, pNPP за AP).
• Спиране на реакцията (ако е необходимо) и измерване на оптична плътност (OD) в микроплачен ридър (често при 450 nm за TMB).
• Калибриране с помощта на стандарти и изчисляване на концентрациите спрямо калибровна крива.

Методи за детекция

• Колориметричен — най-често използван, евтин и лесен за интерпретиране.
• Флуоресцентен — повишена чувствителност и динамичен обхват, изисква флуоресцентен ридър.
• Хемилуминисцентен — много нисък фон и висока чувствителност, подходящ за откриване на малки концентрации.

Приложения

• Клинични тестове: диагностика на инфекции (напр. вирусни, бактериални), откриване на антитела, хормонални нива.
• Научни изследвания: количествено измерване на цитокини, растежни фактори, протеини и др.
• Ваксинни изследвания и контрол на качеството.
• Алергологични тестове и мониторинг на имунен отговор.
• Индустриални приложения: тестване на хранителни продукти, откриване на контаминанти.

ELISPOT и връзката с ELISA

По-сложната и чувствителна техника, методът ELISPOT, е производна на техниката ELISA. Докато ELISA измерва общото количество на целевия белтък или антитяло в течна проба, ELISPOT позволява детекция на секрецията на вещества от отделни клетки — отчита се броят на клетките, които секретират определен цитокин или антитяло, като резултатът е под формата на петна върху мембрана.

Качества, предимства и ограничения

• Предимства: висока специфичност (при добри антитела), възможност за количествено определяне, лесна стандартизация и автоматизация, широк избор от детекционни методи.
• Ограничения: възможни са кръстосани реакции (специфичността зависи от антителата), матрични ефекти от сложни проби (серум, плазма), необходимост от добре подбрани контроли и калибри и ограничена чувствителност при някои формати в сравнение с други техники (напр. мас-спектрометрия, PCR за нуклеинови киселини).

Контрол и калибриране

За надеждни резултати е важно да се използват:

• Стандарти и калибри за изграждане на калибрирана крива (за количествени ELISA).
• Положителни и отрицателни контроли, както и "бланкови" кладенци за определяне на фона.
• Правилни разреждания на пробите, за да попаднат в линейния обхват на калибрираната крива.

Практически съвети

• Оптимизирайте времената и температурите на инкубация според антивъчителите и пробата.
• Използвайте внимателни и последователни промивки, тъй като остатъчни несвързани компоненти водят до повишен фон.
• Ако е възможно, работете в полуавтоматизирани или автоматизирани системи за по-голяма възпроизводимост.
• Съхранявайте антителата и реактивите според инструкциите на производителя и избягвайте многократни замразявания/размразявания.

ELISA остава един от най-разпространените и полезни имунохимични методи в лабораториите поради своята гъвкавост, относителна простота и възможност за количествен анализ. Изборът на правилния формат и внимание към контролите са ключови за получаване на валидни и надеждни резултати.

Въпроси и отговори

В: Какво е ELISA?

В: Как работи ELISA?

В: Какви вещества може да открие ELISA?

В: Какво показва количеството цвят, генерирано от ELISA?

В: ELISA единствената техника, която се използва за откриване на специфични вещества в пробата, ли е?

В: Каква е ролята на втория набор от антитела, използвани в ELISA?

В: Винаги ли ELISA генерира цвят, когато се открие вещество?

Търсене по буква