Молекулярно клониране и рекомбинантна ДНК — дефиниция и методи

Молекулярно клониране и рекомбинантна ДНК: дефиниции, ключови методи, вектори и приложения в биотехнологията и медицината — ясно обяснение и практични примери.

Молекулярното клониране е вид работа в областта на молекулярната биология. Използва се за сглобяване на рекомбинантни ДНК молекули и за насочване на репликацията им в организмите-гостоприемници. Използването на думата клониране означава, че ДНК молекула от една жива клетка се използва за създаване на голяма популация от клетки, съдържащи идентични ДНК молекули. Методите за молекулярно клониране са от основно значение за много области на съвременната биология и медицина.

Молекулярното клониране обикновено използва ДНК последователности от два различни организма: вида, който е източник на ДНК за клониране, и вида, който ще служи като жив гостоприемник за размножаване (репликация) на рекомбинантната ДНК.

При експеримента за молекулярно клониране ДНК, която трябва да се клонира, се получава от интересуващия ни организъм, след което се обработва с ензими в епруветка, за да се получат по-малки ДНК фрагменти. След това тези фрагменти се свързват с векторна ДНК, за да се получат рекомбинантни ДНК молекули. След това рекомбинантната ДНК се въвежда в организъм-гостоприемник (обикновено лесен за отглеждане, доброкачествен лабораторен щам на бактерията E. coli). По този начин се създава популация от организми, в която рекомбинантните ДНК молекули се репликират заедно с ДНК на гостоприемника. Тъй като те съдържат чужди ДНК фрагменти, това са "трансгенни" или генетично модифицирани микроорганизми (ГМО).

Този процес се възползва от факта, че една бактериална клетка може да бъде накарана да приеме и възпроизведе една рекомбинантна молекула ДНК. След това тази единична клетка може да бъде разширена експоненциално, за да се създаде голямо количество бактерии, всяка от които съдържа копия на оригиналната рекомбинантна молекула. По този начин както получената бактериална популация, така и рекомбинантната ДНК молекула обикновено се наричат "клонинги". Строго погледнато, рекомбинантната ДНК се отнася до ДНК молекулите, докато молекулярното клониране се отнася до експерименталните методи, използвани за тяхното сглобяване.

Основни етапи на молекулярното клониране

• Избор на целева последователност: определяне на ген или фрагмент, който трябва да се клонира (например кодиращ регион на протеин, регулаторен елемент или цял геном).
• Изолиране на ДНК: извличане на геномна ДНК или РНК от източника; при нужда се подготвя кДНК чрез обратна транскрипция за клониране на експресирани гени.
• Подготовка на фрагментите: нарязване с рестриктазни ензими, амплификация с PCR или синтез на гени за получаване на точния фрагмент.
• Избор и подготовка на вектор: плазмид, фаген вектор, BAC/YAC или вирусен вектор — векторът трябва да има маркер за селекция и подходящо място за вкарване на чуждия фрагмент (MCS).
• Сглобяване (лигиране): свързване на фрагмента с вектора чрез ДНК лигаза или чрез съвременни методи за безшевно сглобяване (Gibson Assembly, Golden Gate и др.).
• Въвеждане в гостоприемник: трансформация или трансфекция (например в E. coli), електропорация или вирусна инфекция при еукариотни клетки.
• Селекция и скрининг: използване на селективни маркери (антибиотична резистентност), колониален скрининг (blue-white), PCR, рестрикционен анализ и секвениране за потвърждаване на правилната конструкция.
• Съхранение и разширяване: поддържане на доказаните клони като запасни проби и производство на големи количества рекомбинантна ДНК или експресиран протеин.

Типове вектори и ключови характеристики

• Плазмиди: най-често използвани за базово клониране; имат origin of replication, селективен маркер и multiple cloning site.
• Фагови вектори и λ-фаг: за библиотечни приложения и клониране на по-големи фрагменти.
• BAC и YAC: използват се за клониране на много големи фрагменти (по-големи от възможностите на плазмидите).
• Вирусни вектори (аденовирусни, лентивирусни и др.): използват се за вкарване в еукариотни клетки и за изследване/терапия in vivo.
• Експресионни вектори: съдържат промотори, рибозомни сайтoве и сигнални последователности за експресия на протеин в определен гостоприемник.

Съвременни методи за сглобяване на ДНК

• Gibson Assembly: свързва множество фрагмента едновременно чрез хомоложна рекомбинация в излишък от ензими.
• Golden Gate: използва Type IIS рестриктази за едновременно и ориентирано сглобяване на много парчета.
• Gateway™: рекомбинационно клониране, основано на site-specific рекомбинация (полезно за прехвърляне между вектори).
• Синтетични гени: директна химическа синтеза на желаната последователност, която се вмъква във вектор без нужда от традиционно "рязане и лепене".
• CRISPR/Cas-свързани подходи: използват се за модифициране на геномите и за интеграция на желани последователности на специфични места.

Приложения

• Производство на рекомбинантни протеини (напр. инсулин, хормони, ензими, антитела).
• Функционално изследване на гени и регулаторни елементи.
• Създаване на генетични библиотеки и изследване на варианти (mutagenesis).
• Разработка на ваксини и диагностични тестове.
• Изследвания в областта на генната терапия и клетъчната биология.
• Синтетична биология и инженеринг на метаболитни пътища.

Безопасност, етика и регулация

Молекулярното клониране носи както научни ползи, така и отговорности. Работата с рекомбинантна ДНК изисква оценка на риска и спазване на биобезопасност (основни нива BSL, използване на доброкачествени щамове, подходяща отпадъчна обработка). Съществуват национални и международни регулации, контролиращи работата с ГМО и клинични приложения (напр. генна терапия). Етичните въпроси включват оценка на потенциалната вреда, прозрачност, обществени консултации и предотвратяване на злоупотреби (dual-use).

Кратко разграничение на термините

Молекулярно клониране се отнася до лабораторните техники за прехвърляне и размножаване на определени ДНК последователности. Това е различно от репродуктивното клониране (извеждане на цял организъм) и от понятия като клонинг на клетки/организми в по-широк смисъл. В повечето лаборатории "клонинг" означава получаване на множество копия на определена ДНК последователност чрез използване на вектори и гостоприемници.

Въпроси и отговори

В: Какво е молекулярно клониране?

В: Как протича процесът на молекулярно клониране?

В: Какво съдържат тези клонове?

В: Колко бактериални клетки могат да бъдат накарани да приемат и репликират една рекомбинантна молекула?

В: Какво се случва, когато тази единична клетка се репликира?

В: Има ли разлика между "рекомбинантно" и "молекулярно клониране"?

Търсене по буква