Грамово оцветяване: принцип, протокол и значение при идентификация на бактерии

Грамово оцветяване: ясен преглед на принципа, стъпковия протокол и значението при идентификация на бактерии — бърз и практичен гид за лабораторни изследвания.

Оцветяването по Грам (или методът на Грам) е основен лабораторен тест за класифициране на бактериите в две големи групи: грам-положителни и грам-отрицателни. Името идва от неговия изобретател Ханс Кристиан Грам. Този метод е бърз, евтин и дава ценна първична информация за морфологията и груповата принадлежност на бактериите преди по-нататъшна идентификация или култивиране.

Принцип

Методът на Грам оцветява бактериите в зависимост от химичните и физичните свойства на клетъчните им стени. След основните реакции се наблюдават два различни резултата:

• Грам-положителни бактерии запазват виолетовия/тъмносин цвят (кристално виолетово), защото имат дебел слой пептидогликан, който задържа комплекса между кристалното виолетово и йода (mordant).
• Грам-отрицателни бактерии се обезцветяват при третиране с обезцветител (обикновено алкохол или ацетон-алкохол), тъй като имат тънък слой пептидогликан и външна мембрана с липополизахарид, която не задържа комплекса; след това се контраоцветяват с вторичен багрител (напр. сафранин), което им придава червен или розов цвят.

Ключовите химични стъпки са: първично оцветяване (кристално виолетово), фиксация на оцветител с йод (мордант), обезцветяване (алкохол/ацетон) и контраоцветяване (с афранин или фуксин). Обезцветяването е най-критичният етап — време и интензитет определят правилното разграничение.

Протокол — стъпки (общи препоръки)

• Подготовка на пробата: нанесете тънка хемалова филмова проба върху предметно стъкло; оставете да изсъхне.
• Фиксация: топлинна фиксация чрез бързо преминаване над пламък няколко пъти или химическа фиксация при чувствителни проби. Не прекалявайте с топлината (деформация на клетки).
• Първично оцветяване: приложете кристално виолетово (≈1 минута), изплакнете внимателно с вода.
• Мордант: добавете йоден разтвор (люготва: 0.5–1 минута), изплакнете леко.
• Обезцветяване: прилагайте алкохол или ацетон-алкохол за 5–20 секунди, докато течащата вода стане леко виолетова — прекалено дългото обезцветяване може да доведе до фалшиво грам-отрицателен резултат.
• Контраоцветяване: нанесете сафранин или фуксин (≈30–60 секунди), изплакнете и оставете да изсъхне или попийте с филтърна хартия.
• Микроскопия: наблюдавайте при 1000× увеличение с потапящо масло (oil immersion) за оценка на морфологията и Gram-реакцията.

Времевите интервали и концентрациите могат да варират в зависимост от лабораторните стандарти и използваните реагенти; винаги следвайте вътрешно-лабораторни протоколи и контролни проби.

Интерпретация и клинично значение

• Грам-положителни: често появяват се като лилави/виолетови вериги, клъстери или коки/бацили (напр. Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium). Наличието на дебел пептидогликан има последици за чувствителността към някои антибиотици (напр. β-лактами).
• Грам-отрицателни: червени/розови, често с по-сложна външна мембрана (напр. Escherichia, Pseudomonas, Neisseria). Тази мембрана влияе на проницаемостта и резистентността към антимикробни средства.
• Грам оцветяването почти винаги е първата стъпка при идентифицирането на бактериален организъм и дава указания за последващи култури, биохимични тестове и емпирично лечение.

Ограничения и изключения

• Не всички бактерии се класифицират точно чрез този метод — някои са грам-променливи или неопределени по Грам (например Mycobacterium поради восъчно съдържание; Mycoplasma без клетъчна стена; бактерии в L-форми).
• Старите култури или неправилно фиксирани проби могат да дадат променливи или грешни резултати.
• Някои родове и видове са типично грам-променливи (напр. Corynebacterium може да покаже полиморфизъм).

Практически съвети и контрол

• Винаги използвайте положителен и отрицателен контрол (известни грам-положителни и грам-отрицателни щамове) при въвеждане на нови реагенти или техника.
• Следете време и сила на обезцветяване — те са най-честата причина за неправилни резултати.
• Използвайте чисти и качествени оцветители; съхранявайте реагентите правилно и подменяйте при съмнение за деградация.
• Спазвайте биобезопасност при работа с клинични проби и при фиксация, използвайте защитни средства.

Историческа бележка

Грам разработва техниката в сътрудничество с друг учен - Карл Фридлендер, в болница в Берлин. За първи път обаче Грам използва теста, за да направи бактериите в белите дробове по-лесно забележими. Той публикува готовия си метод през 1884 г. Оттогава оцветяването по Грам остава фундаментален метод в микробиологията и клиничната диагностика.

Въпроси и отговори

В: Какво представлява оцветяването по Грам?

В: Кой е измислил оцветяването по Грам?

В: Как се извършва оцветяването по Грам?

Въпрос: Защо е важно оцветяването по Грам?

В: Могат ли всички бактерии да бъдат класифицирани чрез оцветяване по Грам?

Въпрос: За какво първоначално Грам е използвал оцветяването по Грам?

В: Кога е публикуван методът за оцветяване по Грам?

Търсене по буква